Estudo comparativo da viabilidade de ovário criopreservado por congelamento lento e vitrificação em ratas / Comparative study of ovarian cryopreservation by slow freezing and vitrification in mice

INTRODUÇÃO: A criopreservação de células e tecidos germinativos objetiva proteger o potencial fértil em pacientes submetidas a tratamentos que induzam à infertilidade. Objetivo: Comparar congelamento lento e vitrificação de tecido ovariano e verificar o tipo folicular com maior viabilidade no tecido criopreservado. MATERIAL E MÉTODOS: 58 ratas tiveram seus ovários ressecados, dissecados e fragmentados e divididos em dois grupos: A (27 ratas): criopreservados por congelamento lento; e B (31 ratas) - vitrificados. As amostras foram submetidas à avaliação histológica geral pela coloração com H/E, e à avaliação imunohistoquímica com anti-Ki-67. RESULTADOS: Para análise estatística, os testes paramétricos Qui-quadrado de Student e o teste não-paramétrico de Wilcoxon, com nível de significância de 5% (p menor que 0,05). No momento 0 todas as amostras de ambos os grupos apresentaram histologia normal. Após a criopreservação, todas as amostras do Grupo A apresentaram alterações histológicas em diferentes níveis e, em 55,6% dos fragmentos houve sinais de necrose. Das amostras do Grupo B, 22,6% apresentaram alterações histológicas reversíveis e não houve necrose. A análise imunohistoquímica demonstrou que, na comparação entre os momentos, com relação à positividade para o Ki-67 em folículos primordiais, somente foi observada diferença significativa para o Grupo B. No momento 1, o Grupo B apresentou diferença significativa para a marcação em folículos primordiais (p igual a 0,026) e probabilidade limítrofe em folículos primários (p igual a 0,082). CONCLUSÃO: A vitrificação demonstrou menor grau de degeneração tissular e maior índice de viabilidade folicular. Folículos primordiais são os que apresentam maior viabilidade após a criopreservação

Marcador KI-67 como índice preditivo da viabilidade de ovário criopreservado por congelamento lento e vitrificação em ratas / Ki-67 marker used as a predictive index of the viability of cryopreserved ovaries through slow freezing and vitrification in rats

Avaliar duas técnicas de criopreservação de tecido ovariano: congelamento lento e vitrificação, por meio de marcação imunohistoquímica com anticorpo primário anti ki 67 e verificar o tipo folicular mais resistente à criopreservação. 58 ratas foram submetidas à ooforectomia bilateral e divididas em dois grupos: A: 27 ratas cujos fragmentos ovarianos foram criopreservados com a técnica de congelamento lento e B: 31 ratas cujas secções ovarianas foram criopreservadas por vitrificação. Amostras do tecido foram submetidas à avaliação imunohistoquímica com e observaram-se células foliculares positivas para o marcador. Analisaram-se os fragmentos no momento 0 (dia da ooforectomia) como controle e no 43 dia após esse procedimento, momento 1. Na comparação significativa para marcação em folículos primário e secundário, para ambos os grupos. Na comparação entre os grupos não foi observada diferença significativa no momentoO. No momento 1, o Grupo B apresentou diferença significativa para a marcação em folículos primordiais (p=0,026), ou seja, houve um número maior de amostras Ki67 positivas nesse grupo. A marcação com Ki67 demonstrou que, embora ambos os métodos de congelamento ovariano resultem em tecidos potencialmente viáveis, a vitrificação manteve maior número de folículos primordiais potencialmente funcionantes, podendo ser considerada melhor técnica de criopreservação de tecido ovariano do que o congelamento lento, em ratas. Os folículos primordiais são os que melhor resistem ao processo de criopreservação, tanto por congelamento lento como por vitrificação.

Aspectos histológicos do ovário de coelhas após criopreservação / Histological aspects of rabbit ovarian tissue after cryopreservation

OBJETIVO: avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado, em coelhas. MÉTODOS: fez-se, sob anestesia, a ooforectomia direita de dez coelhas brancas, adultas. Dissecou-se o ovário mantendo-se o córtex com espessura de 1,5 milímetros. Fragmentou-se o tecido em pequenas secções, algumas para o estudo histológico de controle e outras destinadas à criopreservação pelo protocolo de congelamento lento. Passadas seis semanas efetuou-se o descongelamento e fez-se a avaliação histológica. As amostras do controle e do experimento, após processamento, foram coradas pela hematoxilina-eosina para identificação dos aspectos histológicos e submetidas à técnica imuno-histoquímica utilizando-se o PCNA (proliferating cell nuclear antigen) para a avaliação da viabilidade celular. Utilizaram-se os testes não paramétricos "comparação entre duas proporções" e Mann-Whitney e o teste paramétrico t de Student. RESULTADOS: observou-se que no tecido criopreservado só persistiram oócitos primordiais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se: vacuolização citoplasmática em todas as amostras (p=0,039), lise estromal em 50 por cento (p=0,648) e oócitos com contornos irregulares em 80 por cento (p=0,007). Encontraram-se alterações irreversíveis como degeneração hialina e picnose em 30 por cento das amostras (p=0,210). A análise imuno-histoquímica demonstrou os folículos, em diferentes estágios de desenvolvimento, no tecido não congelado e folículos primordiais no tecido criopreservado com positividade para o PCNA, indicando a presença de DNA ativo. CONCLUSAO: no tecido ovariano criopreservado sobrevivem apenas os folículos primordiais; existem alterações histológicas reversíveis (vacuolização citoplasmática, lise estromal, fragmentação das células da granulosa e oócitos com contornos irregulares); alterações irreversíveis, em níveis não significantes (degeneração hialina e picnose) e presença de PCNA positivo em todos os folículos.

Avaliação hormonal indireta e estudo da preservação folicular em tecido ovariano autólogo transplantado para região inguinal em ratos / Indirect hormonal evaluation and study of the follicles preservation in the ovarian transplantation tissue in rats inguinal region

OBJETIVO: O transplante autólogo de tecido ovariano tem sido objeto de estudo de diversos pesquisadores pela perspectiva de manter a funcionalidade deste órgão, mesmo não localizado em seu sítio habitual, sendo daí removido, a fim de minimizar os efeitos causados, por exemplo, pela radioterapia. Este trabalho visa a analisar a efetividade da técnica de autotransplante subcutâneo de tecido ovariano bisseccionado em região inguinal de ratas albinas, próximo aos vasos femorais, através do estudo indireto da produção hormonal, feita pela avaliação da citologia de esfregaços vaginais e do estudo direto da viabilidade tecidual, realizado por meio da análise histológica. MÉTODOS: Analisaram-se 30 ratas, que sofreram ooforectomia bilateral, sendo 15 delas destinadas ao controle e 15 submetidas ao transplante ovariano. Decorridos 28 dias, recuperaram-se e avaliaram-se os enxertos. As análises da citologia dos esfregaços vaginais efetuaram-se no momento 0, ou seja, pré-transplante, e no momento 1, pós-transplante, para os animais de ambos os grupos e a avaliação histológica realizou-se no momento 0 para os dois grupos e no momento 1 para os animais transplantados. RESULTADOS: Os resultados do experimento demonstraram a viabilidade e funcionalidade dos enxertos em 100 por cento das lâminas analisadas, isso verificado através da obtenção de esfregaços em fase de estro para todas as ratas do grupo experimento e da presença de folículos em vários estágios de desenvolvimento, observados nos enxertos recuperados, indicando diretamente a viabilidade do tecido ovariano. CONCLUSÃO: o transplante de tecido ovariano é uma alternativa viável, nas condições do experimento, para a preservação hormonal e folicular, em ratas.